細胞內因子流式細胞檢測（FC)操作步驟

    流式細胞檢測是具有高靈敏度、多參數、單細胞模式、定量能力強等多重優勢的細胞分析方法。其中細胞內因子流式細胞檢測尤其以樣品處理簡單和適用面廣在生物醫學研究中發揮重要作用。 實驗步驟如下：

1. 收集細胞:將經過各種處理的待測細胞（如果是分泌型蛋白檢測需要高爾基體阻斷劑）收集到離心管中，4℃、300g離心5分鐘，棄去上清，收集細胞。

2. Fc受體封閉：利用200μl流式細胞染色液（含0.2%BSA的PBS）重懸細胞，加入50μl Fc受體封閉抗體（利用流式細胞染色液稀釋），冰浴10分鐘。

3. 細胞表面染色：加入50μl細胞表面染色相關流式抗體（利用流式細胞染色液稀釋），冰浴30分鐘。

4. 清洗：各管細胞加入1ml流式細胞染色液，4℃、300g離心5分鐘，棄去上清。

5. 固定破膜：利用上述細胞離心后殘余液體重懸細胞，然后加入250μl細胞固定液，冰浴20分鐘固定細胞。棄去多聚甲醛后，用冰冷PBS洗三遍，每次5分鐘破膜：加入0.25%Triton X-100（PBS配制）破膜20分鐘。

6. 清洗：4℃、600g離心5分鐘，棄去細胞固定液；然后加入1ml破膜液，4℃、600g離心5分鐘，棄去破膜液；再加入1ml破膜液，4℃、600g離心5分鐘，棄去破膜液。

7. 細胞內因子染色：利用200μl破膜液重懸細胞，然后加入50μl細胞內因子染色相關流式抗體（利用破膜液稀釋），冰浴30分鐘。

8. 清洗：加入1ml破膜液，4℃、600g離心5分鐘，棄去破膜液；再加入1ml破膜液，4℃、600g離心5分鐘，棄去破膜液；加入400μl流式細胞染色 液重懸細胞

    9.上機檢測。