酶聯(lián)免疫斑點檢測（ELISPOT）操作步驟

    酶聯(lián)免疫斑點檢測是一種高靈敏度的免疫分析方法，特別適合用于檢測細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在免疫學(xué)研究中發(fā)揮十分重要的作用。其主要原理類似于酶聯(lián)免疫吸附檢測，是將一種針對待測抗原的抗體（捕獲抗體）包被到覆蓋PVDF膜的96孔板中，將細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與細(xì)胞周圍的包被抗體特異性結(jié)合，細(xì)胞洗脫后，再利用標(biāo)記生物素的針對待測細(xì)胞因子其它表位的檢測抗體結(jié)合到待測細(xì)胞因子上，然后離心酶標(biāo)親和素和沉淀型底物反應(yīng)形成的斑點檢測分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。實驗步驟如下：

1. 細(xì)胞培養(yǎng):取出包被了捕獲抗體的96孔PVDF板，接種一定密度的細(xì)胞，在一定刺激條件下，37℃孵育24～72小時。

2. 清洗：利用蒸餾水洗去細(xì)胞。

3. 檢測抗體孵育：PVDF板各孔加入100μl檢測抗體，室溫或37℃孵育1小時。

4. 清洗：倒去檢測抗體，利用洗滌液（含0.1%吐溫20的PBS）清洗PVDF板3次，300μl/孔，每次1分鐘。

5. 酶標(biāo)親和素孵育：各孔加入100μl酶標(biāo)親和素，室溫或37℃孵育0.5小時。

6. 清洗：倒去酶標(biāo)親和素溶液，利用洗滌液清洗酶標(biāo)板3次，300μl/孔，每次1分鐘。

7. 底物反應(yīng)：各孔加入100μl酶反應(yīng)底物，室溫或37℃孵育30分鐘。然后利用蒸餾水清洗3遍洗去底物溶液，待PVDF板自然干燥。

    8. 自動斑點計數(shù)儀檢測酶聯(lián)免疫斑點數(shù)量。